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研究生: 郭美怡
Kuo, Mei-Yi
論文名稱: 利用流式介電泳微流體晶片進行不同含油量微藻之篩選及偵測
Continuous sorting and detection of microalgae with different lipid contents using flow dielectrophoresis microfluidic chip
指導教授: 莊怡哲
Juang, Yi-Je
學位類別: 碩士
Master
系所名稱: 工學院 - 化學工程學系
Department of Chemical Engineering
論文出版年: 2014
畢業學年度: 102
語文別: 中文
論文頁數: 107
中文關鍵詞: 介電泳微流體微藻油含量
外文關鍵詞: dielectrophoresis, microfluidics, microalgae, lipid content
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  • 本研究利用介電泳在微流體晶片中操控微藻細胞進行分離,探討連續偵測藻油的可行性,我們採取的分離機制為在第一及第二電極對使微藻細胞受到負介電泳力的作用使其可以被導引及排列成一直線,而在第三電極對時讓不同含油量的微藻細胞受到不同程度的負介電泳力的作用使其達到分離之效果。當微藻細胞受到強的負介電泳力作用時會被分離電極對排斥往支流道流動;受到弱的負介電泳力作用時,會受到流體拖曳力(hydrodynamic force)的作用而繼續往主流道移動。我們發現微藻的crossover frequency隨著含油量的增加而上升,首先以300kHz的操作頻率將微藻以電極對排列成一直線,再以較高的頻率來分離不同含油量之微藻,如7MHz分離含油量13%以下和21%以上的微藻,或是10MHz分離含油量24%以下和30%以上之微藻。而透過螢光強度的檢測,可以針對含油量24%以下和35%以上微藻的分離作判別。

    In this study, a continuous flow dielectrophoresis (DEP) microfluidic chip was fabricated and utilized to sort out the microalgae (C. vulgaris) with different lipid contents. The proposed separation scheme is to allow the microalgae with different lipid contents experience different negative or no DEP force at the separation electrode pair under the pressure-driven flow. The microalgae which experience stronger negative DEP will be directed to the side channel while those experience less negative or no DEP force will pass through the separation electrode pair to remain in the main channel. It was found that the higher the lipid content inside the microalgae, the higher the crossover frequency. Separation of the microalgae with 13% and 21% lipid contents, and 24% and 30-35% lipid contents was achieved at the operating frequency 7 MHz, and 10 MHz, respectively. Moreover, separation can be further indicated/verified by measurement of the fluorescence intensity of the neutral lipid inside the sorted algal cells.

    目錄 中文摘要 I Extended Abstract II 誌謝 VI 目錄 VII 表目錄 X 圖目錄 XI 第一章 緒論 1 1.1 前言 1 1.2 研究動機與方法 2 第二章 文獻回顧 3 2.1 介電泳力在生物科技上的應用 3 2.1.1 介電泳基本原理 3 2.1.2 介電泳在批次分離生物細胞的應用 5 2.1.3 介電泳在連續分離生物細胞的應用 8 2.2 微藻 11 2.2.1 油脂含量分析方法 13 第三章 實驗材料與方法 35 3.1 實驗藥品與材料 35 3.2 實驗儀器 40 3.3 微藻培養 48 3.3.1 藻種與藻種保存 48 3.3.2 實驗方法 48 3.4 介電泳晶片之製作 55 3.4.1 介電泳裝置金(Au)電極的製作 55 3.4.2 微流道的製作 59 3.4.3 介電泳裝置的組裝 62 3.5 PS粒子和微藻細胞通入介電泳裝置之實驗 65 3.6 螢光強度的檢測 69 3.6.1 尼羅紅( Nile red)染色法 69 3.6.2 分析與檢測 70 第四章 結果與討論 74 4.1 介電泳批次微流體裝置 74 4.1.1 不同粒徑的PS粒子的介電泳行為 75 4.1.2 不同含油量的微藻的介電泳行為 77 4.2 介電泳連續分離微流體裝置 85 4.2.1 不同粒徑的PS粒子的分離 87 4.2.2 不同含油量的微藻的分離 88 4.3 微藻的螢光強度分析 97 第五章 結論 100 第六章 未來工作與建議 101 第七章 參考文獻 102 附錄一 藻細胞內還原金粒子用於增顯拉曼訊號 105 表目錄 表3-1 basal medium (Shi et al., 1997) 51 表3.2 HMDS與S1818光阻旋轉塗佈參數 56 表3.3 S1818光阻曝光參數 58 表3.4 JSR光阻旋轉塗佈參數 60 表3.5 JSR光阻曝光參數 61 表4.1在電壓20Vpp ,溶液導電度為1.3μS/cm下,不同粒徑的 PS粒子在不同操作頻率下的介電泳行為 77 表4.2在電壓20Vpp,導電度2.9mS/cm 下,不同油含量的小球藻在不同操作頻率下的介電泳行為(-----為在crossover frequency附近)。 81 表4.3在電壓20Vpp,導電度1.4mS/cm 下,不同油含量的小球藻操作在不同頻率下的介電泳行為(-----為在crossover frequency附近)。 82 圖目錄 圖2-1 DEP作用示意圖。(a)粒子的極化能力大於溶液,會朝向電場梯度大的地方移動,此為正介電泳 (b)粒子的極化能粒小於溶液,會朝向電場梯度小的地方移動,此為負介電泳。 15 圖2-2 四項式電極電場強度分布。[5] 15 圖2-3 城垛式電極電場強度分布。[5] 15 圖2-4 多項式電極的介電泳現象。(a)作用於頻率5MHz,電壓5Vpp時,粒子往電場較小處移動,形成負介電泳 (b)作用於頻率500kHz,電壓8Vpp時,粒子往電場較大處移動,形成正介電泳。[5] 16 圖2-5 城垛式電極的介電泳現象。(a)作用於頻率8MHz,電壓8Vpp時,粒子往電場較小處移動,形成負介電泳 (b)作用於頻率700kHz,電壓8Vpp時,粒子往電場較大處移動,形成正介電泳。[5] 17 圖2-6在電壓10Vpp、頻率2MHz之電場操作下,即可分離216nm紅色粒子和557nm綠色粒子。其中216nm紅色粒子為pDEP,557nm綠色粒子為nDEP。[6] 18 圖2-7在電壓5Vpp、頻率6MHz之電場操作下,(a)TMV為pDEP (b)HSV為nDEP。[6] 18 圖2-8在電壓5Vpp、頻率6MHz之電場操作下,即可分離TMV和HSV。其中TMV(紅色)為pDEP,HSV(綠色)為nDEP。[6] 19 圖2-9 酵母菌和乳酸菌的Re(fCM)對頻率關係圖。其中電解質導電度為0.025Sm-1。[8] 19 圖2-10 在頻率10MHz,電壓15Vpp,電解質導電度0.025Sm-1 (A)乳酸菌被捕捉於電極尖端 (B)酵母菌被捕捉於電極入口 (C)乳酸菌和酵母菌被捕捉於不同地點的分離情形 (D)電極電場強度分布圖,虛線為乳酸菌聚集範圍,實線為酵母菌聚集範圍。[8] 20 圖2-11在頻率100kHz,電壓15Vpp,電解質導電度0.025Sm-1 (A)乳酸菌為pDEP會被捕捉於電極尖端 (B)酵母菌為nDEP,會被電極排斥 (C)乳酸菌和酵母菌的分離情形 (D)電極電場強度分布圖,虛線為乳酸菌聚集範圍,實線為酵母菌聚集範圍。[8] 21 圖2-12 在電壓15Vpp,頻率100kHz,在不同流量時酵母菌和乳酸菌分離情形 (A)0.35μl/min-0.7μl/min (B) (0.7μl/min-1.25μl/min) (C) (1.25μl/min-2μl/min)。[8] 22 圖2-13在電壓20Vpp、頻率20MHz、電解質導電度2.95mSm-1之電場操作下,(a)45wt%為nDEP (b)11wt%為pDEP。[9] 23 圖2-14在電壓20Vpp、頻率20MHz、電解質導電度2.95mSm-1之電場操作下,含油量11wt%(透明的點)和45wt%(亮的點)的小球藻分離情況。[9] 23 圖2-15 電極示意圖依序為‘funnel’(F)、‘aligner’(A)、‘cage’(C)、‘funnel’(F)、‘sort’(S)。[10] 24 圖2-16粒子受到負介電泳力而聚焦(focus)成一直線示意圖。[10] 24 圖2-17 城垛狀電極將粒子對準成一顆示意圖。[10] 25 圖2-18 八根電極形成的介電場籠將粒子捕捉在中間示意圖。[10] 25 圖2-19 粒子分離示意圖。[10] 25 圖2-20利用DEP分離活酵母菌和死酵母菌的流程圖。[11] 26 圖2-21 流道內活酵母菌和死酵母菌的分離情形。[11] 26 圖2-22 分離血球和血清的微流體裝置示意圖。[12] 26 圖2-23 對稱曲線電極電場強度示意圖。[12] 27 圖2-24 血液中細胞的極化曲線,頻率操作於200kHz時細胞呈現負介電泳。[12] 27 圖2-25 血清和血球的分離示意圖,於頻率200kHz時細胞呈現負介電泳,而血清不受介電泳力影響,而達到分離。[12] 28 圖2-26 粒子在V型電極聚焦和分離的原理,(a,b,c)為流道剖面圖,(d,e)為流道俯視圖。[13] 28 圖2-27 (a-d)是PS粒子的聚焦圖,(e,f)是孢子的聚焦圖。[13] 29 圖2-28 PS粒子和孢子利用DEP特性分離情況,(a,b)為螢光照片,(d,e)為暗視野照片。[13] 29 圖2-29 裝置各個點的螢光強度分析(a-d)和散射強度分析(e-h)。[13] 30 圖2.30 各種微藻之油含量(%)。[16] 30 圖2.31 正常氮源情況下,小球藻的油含量(%)和培養天數關係圖。[22] 31 圖2.32 氮源變成四分之一的情況下,小球藻的油含量(%)和培養天數關係圖。[22] 31 圖2.33小球藻的螢光強度與油含量的關係。[29] 32 圖2.34染色前後,小球藻的放射波長與螢光強度的關係。[29] 32 圖2.35不同藻類與螢光強度的關係。[30] 33 圖2.36 Nile red濃度與螢光強度的關係。[30] 33 圖2.37染色溫度與螢光強度之關係。[30] 34 圖2.38染色後螢光強度隨著時間衰退。[31] 34 圖3.1旋轉塗佈機(spin coater) 40 圖3.2 EVG紫外線固化式奈米壓印機(UV-Curing Nanoimprinter ) 41 圖3.3微量電子天平 42 圖3.4熱電耦溫控加熱板 42 圖3.5電子槍蒸鍍系統(E-beam Deposition System) 43 圖3.6波形產生器 44 圖3.7針筒式注射幫浦 45 圖3.8螢光顯微鏡 45 圖3.9數位式加熱攪拌器(Stirring Hot Plates) 46 圖3.10分光光度計(UV-Visible Spectrophotometer) 47 圖3.11冷凍乾燥機(Freeze Dryer) 47 圖3.12小球藻(Chlorella vulgaris) 50 圖3.13微藻培養系統 50 圖3.14金(Au)電極製作流程圖 59 圖3.15連續式流道製作流程圖 62 圖3.16 介電泳批次裝置圖 63 圖3.17 DEP連續分離裝置熱接合示意圖 64 圖3.18 介電泳連續分離裝置圖 64 圖3.19 介電泳批式裝置實驗示意圖 68 圖3.20 介電泳連續式分離裝置實驗示意圖 68 圖3.21 選取一個矩形的檢測區域 70 圖3.22 選取想要檢測的參數 71 圖3.23 選擇檢測區間 72 圖3.24選擇檢測區間 72 圖3.25 檢測結果列表 73 圖4.1介電泳批次微流體裝置的六根平行電極,電極寬30μm。 74 圖4.2介電泳批次微流體裝置中(a)粒子未施加交流電時的情況(b)施加交流電後,粒子被吸引至電場梯度強的地方(c) 施加交流電後,粒子被吸引至電場梯度弱的地方。 75 圖4.3在電壓20Vpp ,溶液導電度為1.3μS/cm下(a)粒徑0.4μm (b) 粒徑3μm (c) 粒徑5μm在不同頻率下的介電泳行為。 76 圖4.4在電壓20Vpp,導電度2.9mS/cm 下,小球藻油含量(a)13% (b) 21% (c) 24%分別在不同操作頻率下的介電泳行為。 79 圖4.5在電壓20Vpp,導電度2.9mS/cm 下,小球藻油含量(a)27% (b) 30% (c) 35%分別在不同操作頻率下的介電泳行為。 80 圖4.6在電壓20Vpp,導電度2.9mS/cm 下,不同油含量的小球藻crossover frequency示意圖。 81 圖4.7在電壓20Vpp,導電度1.4mS/cm 下,小球藻油含量(a)21% (b) 30% (c) 35%操作在不同頻率下的介電泳行為。 82 圖4.8在電壓20Vpp,導電度1.4mS/cm 下,不同油含量的小球藻crossover frequency示意圖。 83 圖4.9在電壓20Vpp,油含量30%的小球藻操作在不同頻率下,溶液導電度為(a) 1.3μS/cm (b) 1.4 mS/cm (c) 2 mS/cm (d) 2.9 mS/cm下的介電泳行為。 84 圖4.10在電壓20Vpp,含油量30%的小球藻在不同導電度下的crossover frequency示意圖。 85 圖4.11介電泳連續分離微流體裝置電極設計圖。 86 圖4.12介電泳連續分離微流體裝置作用機制圖。 86 圖4.13在電壓20Vpp、導電度1.3μS/cm (a)頻率為20MHz,3 μm和5 μm PS粒子對準圖(b)頻率為500kHz 3 μm和5 μm PS粒子分離圖。 88 圖4.14在電壓20Vpp、導電度2.94mS/cm、頻率7MHz ,含油量 (a)13% (b)21% 的小球藻在流動系統下的介電泳行為。 90 圖4.15在電壓20Vpp、導電度2.94mS/cm (a)頻率為300kHz,小球藻對準圖(b)頻率為7MHz小球藻分離圖。 90 圖4.16在電壓20Vpp、導電度2.94mS/cm、頻率10MHz,含油量 (a)24% (b)30% 的小球藻在流動系統下的介電泳行為。 92 圖4.17在電壓20Vpp、導電度2.94mS/cm (a)頻率為300kHz,小球藻對準圖(b)頻率為10MHz ,24%和30%的小球藻分離圖。(虛線代表電極,實線代表流道壁) 92 圖4.18在電壓20Vpp、導電度2.94mS/cm的流動系統下,24%和30%的混合藻液在不同頻率下的介電泳行為。(虛線代表電極,實線代表流道壁) 93 圖4.19在電壓20Vpp、導電度2.94mS/cm、頻率10MHz,含油量 (a)24% (b)35% 的小球藻在流動系統下的介電泳行為。 95 圖4.20在電壓20Vpp、導電度2.94mS/cm (A)頻率為300kHz,小球藻對準圖(B)頻率為10MHz,24%和35%的小球藻分離圖。(band-pass types filter) 95 圖4.21在電壓20Vpp、導電度2.94mS/cm的流動系統下,24%和35%的混合藻液在不同頻率下的介電泳行為(band-pass types filter) 96 圖4.22不同含油量的小球藻的靜態螢光強度圖。 97 圖4.23在電壓20Vpp、導電度2.94mS/cm 頻率為10MHz 下,24%(stained)和30%(stained)的小球藻分離螢光強度分析圖(long-pass types filter)。 98 圖4.24 含油量24%(stained)和30%(stained)的小球藻分離螢光強度圖(long-pass types filter)。 98 圖4.25在電壓20Vpp、導電度2.94mS/cm 頻率10MHz 下,24%和35%的小球藻分離螢光強度分析圖(band-pass types filter)。 99 圖4.26 含油量24%和35%的小球藻分離螢光強度圖(band-pass types filter)。 99 圖A.1 藻細胞內還原金的溶液顏色變化 106 圖A.2 藻細胞還原15分鐘離心後的上清液uv-visibe分析圖 106 圖A.3 未加四氯金酸的藻細胞和有添加四氯金酸的藻細胞的暗視野圖 107 圖A.4 未加還原劑的藻細胞和有添加四氯金酸的藻細胞的拉曼分析圖 107

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    下載圖示 校內:2019-07-30公開
    校外:2019-07-30公開
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