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研究生：	胡竣翔 Hu, Jyun-Siang
論文名稱：	不同鏈黴菌株生產抗生活性物質能力之比較 The comparison of the ability of producing antibiotic compounds by different species of Streptomyces
指導教授：	高銘木 Kao, Ming-Muh
學位類別：	碩士 Master
系所名稱：	工學院 - 環境工程學系 Department of Environmental Engineering
論文出版年：	2007
畢業學年度：	95
語文別：	中文
論文頁數：	120
中文關鍵詞：	鏈黴菌屬、吸收光譜、透明圈、醱酵培養、分子生物技術
外文關鍵詞：	spectrum, clear zone, fermentation, molecular biology technique, Streptomyces
相關次數：	點閱：158 下載：8
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本研究針對澄清湖水庫底泥中進行放線菌的篩選，搭配分子生物技術鑑定菌株，希望能經由醱酵培養後產生具抑制效果之活性物質，並藉由UV-Vis光譜分析及透明圈表現來建立抗菌圖譜。
經分子生物技術鑑定從底泥中篩選出之菌種，其結果顯示，共篩選出7株放線菌，其中4株屬於Streptomyces屬，分別為菌種B23、B31、B32、B35，而只有B31經比對後為Streptomyces hosalacineus，其餘3株均比對出許多親緣關係較相近之菌種；而菌種B38與菌種B41，為放線菌中Nocardia的Rhodococcus屬；另1株菌種A3，則為Cellulosimicrobium cellulans。
最適萃取劑部份，以甲、乙醇作為醱酵液萃取劑之效果明顯優於乙酸乙酯。UV-Vis吸收光譜部份，選購之純菌其最大吸收波長約257-260nm，而自篩之鏈黴菌最大吸收波長約在254-264nm之間，且亦進一步發現不同醱酵培養天數為造成最大吸收波長不同之主要的影響因子之一。
拮抗活性表現方面，選購純菌之透明圈表現普遍較自篩菌為佳，而在自篩菌方面，其對E. coli所展現之透明圈最大、Fungi居次，Bacillus亦有不錯效果，故可推論經醱酵培養所產生之活性物質對於革蘭氏陰性菌及絲狀真菌之拮抗效果較佳，而在Yeast及Staphylococus部份，由透明圈的觀察結果可發現，無論是選購純菌或自篩菌，對其展現之拮抗性皆較其餘測試菌株為低，顯示其產生之拮抗效果相當有限。

關鍵字：鏈黴菌屬、分子生物技術、醱酵培養、吸收光譜、透明圈

This study mainly investigated molecular biology technique to identify Actinomycetes were isolated from sediment of the Cheng-Ching reservoir and estimated the effectiveness of inhibition of the active compounds-produced during fermentation process. Then, the analysis of UV spectrum was accomplished to observe the range of clear zones and establish the antibacterial spectrum.
The results of molecular biology technique showed that there are seven kinds of Actinomycetes were isolated from the sediment. After we contrasted with the database from NCBI website, we found that the B23, B31, B32, B35 could be identified as Streptomyces. The results showed B31 is classified to Streptomyces hosalacineus, and the others have closed-relationship from the phylogenetic tree. At last, B38 and B41 are identified as Rhodococcus of Nocardia and A3 is confirmed as Cellulosimicrobium cellulans.
In the experiments of proper extraction solvent, we found methanol or ethanol as extract during fermentation procedure were better than ethyl acetate. In the analysis of UV spectrum, the highest absorbance was observed at 257nm to 260nm and 254nm to 264nm of the pure cultures from BCRC and bacteria isolated from sediment, respectively. The results of fermentation indicated that different fermentation periods are one of the major factors to induce the variations of the highest absorbance.
The performance of clear zone with pure culture is better than bacteria isolated from sediment. The orders of clear zone range of test organisms were E. coli、Fungi and Bacillus. The inhibited effects from active compounds of Gram negative and mycelium fungus after fermentation were better than other test organisms. Regardless of pure culture from BCRC or bacteria isolated from sediment, the inhibited effects of Yeast and Staphylococus were both lower than others.

Key words：Streptomyces, molecular biology technique, fermentation, spectrum, clear zone

摘要　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    I
Abstract　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    III
誌謝　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    V
目錄　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　   VI
表目錄　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　   IX
圖目錄　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　   XI
第一章	前言　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    1
　　1-1　研究緣起　　　　　　　　　　　　　　　　　　　     1
　　1-2　研究目的　　　　　　　　　　　　　　　　　　　     3
第二章	文獻回顧　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    4
　　2-1　放線菌的生活史　　　　　　　　　　　　　　　　     4
　　2-2　放線菌分類　　　　　　　　　　　　　　　　　　     6
　　2-3　放線菌分離條件探討　　　　　　　　　　　　　　    12
　　2-4　分子生物技術應用於菌種鑑定的研究　　　　　　　    16
　　　2-4-1　DNA萃取　　　　　　　　　　　　　　　　　　   17
　　　2-4-2　聚合酶鏈鎖反應　　　　　　　　　　　　　　    17
　　　2-4-3　瓊脂膠體電泳(Gel Electrophoresis)　　　　　   21
　　　2-4-4　分子選殖(Cloning)　　　　　　　　　　　　　   21
　　　2-4-5　限制酵素片段長度多型性(RFLP)　　　　　　　    22
　　　2-4-6　定序　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    23
　　2-5　抗生素之作用機轉　　　　　　　　　　　　　　　    23
　　2-6　醱酵培養　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    25
　　2-7　活性物質之萃取與純化　　　　　　　　　　　　　    27
　　2-8　吸收光譜　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    28
第三章	實驗材料與方法　　　　　　　　　　　　　　　　　   30
　　3-1　實驗器材與藥品　　　　　　　　　　　　　　　　    31
　　3-2　菌種來源　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    35
　　3-3　菌種培養與純化　　　　　　　　　　　　　　　　    35
　　3-4　菌種的保存與增量　　　　　　　　　　　　　　　    37
　　3-5　DNA萃取　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　   37
　　3-6　聚合酶鏈鎖反應　　　　　　　　　　　　　　　　    39
　　3-7　Cloning　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　   41
　　　3-7-1　切膠與溶膠　　　　　　　　　　　　　　　　    42
　　　3-7-2　Ligation(接合反應)　　　　　　　　　　　　    44
　　　3-7-3　製備LBA Medium　　　　　　　　　　　　　　    46
　　　3-7-4　勝任細胞之轉殖　　　　　　　　　　　　　　    47
　　　3-7-5　藍白篩挑菌　　　　　　　　　　　　　　　　    48
　　　3-7-6　萃取plasmid DNA　　　　　　　　　　　　　　   48
　　3-8　RFLP　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    50
　　3-9　定序與親緣關係分析　　　　　　　　　　　　　　    52
　　3-10 醱酵培養　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    58
　　　3-10-1　最適萃取劑測試　　　　　　　　　　　　　　   58
　　3-11 透明圈觀察　　　　　　　　　　　　　　　　　　    59
第四章	結果與討論　　　　　　　　　　　　　　　　　　　   60
　　4-1	環境樣品中菌種之篩選與鑑定　　　　　　　　　　　   60
　　　4-1-1　選擇分離培養基　　　　　　　　　　　　　　    60
　　　4-1-2　DNA萃取　　　　　　　　　　　　　　　　　　   61
　　　4-1-3　PCR反應　　　　　　　　　　　　　　　　　　   62
　　　4-1-4　Insert Check　　　　　　　　　　　　　　　    65
　　　4-1-5　RFLP　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    70
　　　4-1-6　定序與親緣關係分析　　　　　　　　　　　　    74
　　4-2　最適萃取劑選定　　　　　　　　　　　　　　　　    77
　　4-3　吸收光譜                                          78
　　　4-3-1　自行選購純菌醱酵液之吸光度分析　　　　　　    78
　　　4-3-2　環境樣品醱酵液之吸光度分析　　　　　　　　    83
　　4-4	拮抗活性表現　　　　　　　　　　　　　　　　　　   87
　　　4-4-1　自行選購純菌之表現　　　　　　　　　　　　    87
　　　4-4-2　環境樣品中自篩菌之表現　　　　　　　　　　    92
第五章	結論與建議　　　　　　　　　　　　　　　　　　　   95
　　5-1　結論　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    95
　　5-2　建議　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    97
參考文獻　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　   98
附錄　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    106
自述　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    120

表目錄
表2-1　分枝桿菌科之相關特性                                 7
表2-2　放線菌屬之相關特性                                   8
表2-3　諾卡氏菌屬之相關特性                                 9
表2-4　鏈黴菌屬之相關特性                                  10
表2-5　Streptosporangiaceae之相關特性                      11
表2-6　動物糞便樣本在不同前處理法下所篩得之放線菌菌數      12
表2-7　動物糞便樣本在不同分離培養基下所篩得之放線菌菌數    14
表2-8　不同前處理法下糞生放線菌在不同分離培養基中的分佈情形15
表2-9　鑑定鏈黴菌屬之專一性primer                          19
表2-10 PCR之反應條件                                       20
表2-11 影響生產抗生素因子                                  26
表3-1　Bennett’s Agar配製組成                             31
表3-2　Actinomycete Isolation Agar, AIA                    31
表3-3　Yeast extract-Malt extract Agar                     32
表3-4　Yeast extract Glucose Medium, YGM                   32
表3-5　Fermentation Medium                                 32
表3-6　Malt Extract Agar I                                 33
表3-7　Yeast extract-Malt extract Agar Medium, YMA         33
表3-8　分子生物實驗藥品                                    33
表3-9　實驗儀器設備                                        34
表3-10 PCR反應試劑添加量                                   40
表3-11 Ligation加藥量                                      45
表3-12 限制酶酵素之切點                                    51
表3-13 RFLP所需試劑與用量                                  51
表4-1　PCR反應循環參數之比較                               62
表4-2　菌種S3經萃取後之抗菌活性表現                        77
表4-3　三株選購之鏈黴菌經生長培養7天後之抗菌活性表現       90
表4-4　三株選購之鏈黴菌經生長培養14天後之抗菌活性表現      91
表4-5　四株自篩鏈黴菌經生長培養7天後之抗菌活性表現         94
 
圖目錄
圖3-1　實驗架構流程圖                                      30
圖3-2　Cloning流程圖                                       41
圖3-3　序列整理格式                                        52
圖3-4　序列貼上處                                          53
圖3-5　轉換中示意圖                                        53
圖3-6　轉換結果示意圖                                      53
圖3-7　序列前端修整前示意圖                                54
圖3-8　存成FASTA格式示意圖                                 54
圖3-9　修改格式內容示意圖                                  55
圖3-10 操作示意圖                                          55
圖3-11 選擇載入類型                                        56
圖3-12 確認視窗                                            56
圖3-13 選擇NJ計算法                                        56
圖3-14 Bootstrap參數設定                                   57
圖3-15 分析參數示意圖                                      57
圖3-16 分液漏斗分層圖                                      59
圖3-17 DSTA測試培養基                                      59
圖4-1　DNA萃取電泳膠片圖                                   61
圖4-2　徐(2005)之PCR反應條件下之電泳膠片圖                 63
圖4-3　本研究所使用之PCR反應條件下之電泳膠片圖             64
圖4-4　菌種B23 Insert Check示意圖                          65
圖4-5　菌種B31 Insert Check示意圖                          66
圖4-6　菌種B32 Insert Check示意圖                          66
圖4-7　菌種B35 Insert Check示意圖                          67
圖4-8　菌種B38 Insert Check示意圖                          67
圖4-9　菌種B41 Insert Check示意圖                          68
圖4-10 菌種A3 Insert Check示意圖                           68
圖4-11 菌種B23之RFLP示意圖                                 71
圖4-12 菌種B31之RFLP示意圖                                 72
圖4-13 菌種B32之RFLP示意圖                                 72
圖4-14 菌種B35之RFLP示意圖                                 73
圖4-15 實驗菌種比對之親緣關係圖                            76
圖4-16 菌種S1生長7天後不同醱酵天數和萃取劑下吸收峰比較圖   79
圖4-17 菌種S1生長14天後不同醱酵天數和萃取劑下吸收峰比較圖　79
圖4-18 菌種S2生長7天後不同醱酵天數和萃取劑下吸收峰比較圖　 80
圖4-19 菌種S2生長14天後不同醱酵天數和萃取劑下吸收峰比較圖　80
圖4-20 菌種S3生長7天後不同醱酵天數和萃取劑下吸收峰比較圖　 81
圖4-21 菌種S3生長14天後不同醱酵天數和萃取劑下吸收峰比較圖　81
圖4-22 菌種B23生長7天後不同醱酵天數和萃取劑下吸收峰比較圖　84
圖4-23 菌種B31生長7天後不同醱酵天數和萃取劑下吸收峰比較圖　84
圖4-24 菌種B32生長7天後不同醱酵天數和萃取劑下吸收峰比較圖　85
圖4-25 菌種B35生長7天後不同醱酵天數和萃取劑下吸收峰比較圖　85
圖4-26 透明圈示意圖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　87
                                    

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校內：2008-07-20公開
校外：2008-07-20公開

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