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研究生： 陳怡芳
Chen, Yi-Fang
論文名稱： 可供一氧化氮檢測的毛細管電泳電化學晶片之研發
Development of Capillary Electrophoretic Chip with Electrochemical Detector for Detecting Nitric Oxide
指導教授： 張憲彰
Chang, Hsien-Chang
學位類別： 碩士
Master
系所名稱： 工學院 - 醫學工程研究所
Institute of Biomedical Engineering
論文出版年： 2006
畢業學年度： 94
語文別： 中文
論文頁數： 83
中文關鍵詞： 毛細管電泳晶片 、NO 、中風 、電化學
外文關鍵詞： electrochemical detection, capillary electrophoresis., nitric oxide, stroke
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    • 一氧化氮(NO)與中風的形成在血管調節與神經細胞死亡過程關係密切；當中風成因之ㄧ的腦血管阻塞發生時，血管舒張因子(EDRF) NO釋放來調節其血管舒張。而在血管阻塞後導致的氧氣葡萄糖供輸受阻，會誘發週遭腦神經細胞內NO的大量生合成，進而使該部位的細胞次第受損，神經退化性疾病因應而生。故能藉由NO的量測來了解血液測試下血管阻塞情形，並可藉之評估細胞的受損情況。但NO在生理條件下並不安定，然可藉由其較安定的氧化態亞硝酸根(NO2-)、硝酸根(NO3-)之量測來對應。本研究即著力發展可偵測NO2-、NO3-的毛細管電泳電化學(CEEC)晶片，期望將來能被用於血液的快速檢測。此晶片乃以微機電製程，製作出具電化學微小電極之玻片與十字微流管道，以氧電漿處理接合及矽烷化反應的管道修飾，其電滲流遷移率(μEOF=5.79×10-4 cm2/sV)較經由氧電漿處理所呈現的(μEOF =4.23×10-4 cm2/sV)及NaOH處理者(μEOF =4.58×10-4 cm2/sV)為佳且穩定。NO2-以金工作電極，電位設定為+0.75 V (相對鉑擬參考電極)，當注入與分離電場各為100 與80 V/cm，而當晶片的μEOF處在4.78×10-4 cm2/sV時，NO2-於分離後140 sec出現，在0.5~10 μM之間呈正相關(R2=0.9104)，偵測極限可達0.1 μM。另在達成一次即能檢測NO2-與NO3-的總濃度之努力上，我們以鎘沉積於注入管道內，亦即先把還原NO3-，使其全變成NO2-，終究是量測所有的NO2-的方式來反應NO的含量。最後，也嘗試以鎘工作電極定電位於-0.80 V來量測NO3-，然現僅能於10~500 mM之間得到濃度與電流響應呈正相關(R2=0.9457)。當晶片之μEOF = 4.70×10-4 cm2/sV時，NO3-訊號於分離後約180 sec出現。如上結果，顯示將可作為設計雙工作電極的參考，以對真實樣本進行NO2-及NO3-的同時定量。

    Nitric Oxide (NO) is closely related with vessel regulation and neuron death process. NO, endothelium-derived relaxing factor (EDRF), is released to regulate vessel when cerebral vessel is blocked. As ischemia, NO plays an important role in cell death process. Cerebral neurons around brocked vessel causing oxygen and glucose deficiency would be induced to synthasize and release NO. That leads to neurons damage and causes neurodegenerative diseases. So if NO could be monitored by blood test, the vessel blocked condition may be understood and further evaluted the level of neuron damage. But NO is unstable in biological fluid, however, it could be measured by evaluating its oxidative delivertives, nitrite and nitrate. In this study, we developed capillary electrophoretic chips with electrochemical detector (CEEC) for the detection nitrite and nitrate. The resulting chips were fabricated MEMS processes through O2 plasma following silianization treatment. As a result, we found that the μEOF showed a value in 5.79×10-4 cm2/sV, it is more stable than the treatments with O2 plasma (4.23×10-4 cm2/sV) or NaOH immersing procedure (4.58×10-4 cm2/sV). As the detecting potential is set at +0.75 V (vs. pseudoplatinum), nitrite signal appears at around 140 sec when the injection field is 100 V/cm, separation field is 80 V/cm, and μEOF of the chip is 4.78×10-4 cm2/sV. Nitrite responded linearly in 0.5~10 μM (R2=0.911) and the limit of detection is 0.1 μM. On the other hand, we also deposited cadimium and integrated it in the injection channel to reduce nitrate, however, it only resulted in a linear response to nitrate from 10 to 500 mM (R2=0.946) as the potential set at -0.8 V. Nitrate signal appears at ca. 180 sec when injection field is 100 V/cm, separation field and μEOF of the chip are 80 V/cm and 4.70×10-4 cm2/sV, respectively. The results described above provide us a valuable indicator to design the CEEC chip that can quantitatively detect nitrite and nitrate in one test.

    目次 摘 要 I Abstract III 誌謝 IV 目次 V 表目錄 VIII 圖目錄 IX 第1章 緒論 1 1.1 研究背景與目的 1 1.2 中風於臨床的診斷與治療 4 1.2.1 病史詢問及神經學檢查 4 1.2.2 血液檢查 4 1.2.3 中風臨床的治療 6 1.3 一氧化氮 7 1.3.1 NO的生理反應 7 1.3.2 NO的生合成 9 1.3.3 NO媒介神經毒 11 1.3.4 NO於培養液中的反應 13 1.3.5 血漿中之NO 15 1.3.6 NO的檢測法 16 1.4 毛細管電泳原理 17 1.4.1 電泳遷移率 (electrophoretic mobility, me) 19 1.4.2 電滲流 (electroosmotic flow, EOF) 21 1.4.3 影響電滲流遷移率(mEOF)的因素 23 1.4.4 毛細管電泳中的流動剖面圖 24 1.4.5 電泳樣本濃縮的原理 25 1.4.6 以毛細管電泳偵測NO 26 1.5 現今檢測NO之商品 27 1.6 電化學偵測方法 29 1.6.1 NO2-的氧化 30 1.6.2 NO3-的還原 30 1.7 研究架構 31 第2章 實驗設備與材料方法 32 2.1 研究設備 32 2.2 實驗藥劑與配製方法 33 2.3 毛細管電泳晶片之製作 34 2.3.1 玻璃電極晶片的製作 34 2.3.2 十字微流管道的製作 39 2.3.3 電極晶片與微流管道的接合 41 2.3.4 白金電極的電鍍 42 2.4 實驗系統架構 43 2.4.1 三極式電化學槽系統架構 43 2.4.2 毛細管電泳量測系統 43 2.5 實驗方法 45 2.5.1 EOF量測 45 2.5.2 氧電漿(O2 plasma)處理 46 2.5.3 表面矽烷化反應修飾 46 2.5.4 NO2-之電化學活性評估 47 2.5.5 鎘粒子對NO3-的還原 47 2.5.6 鎘電極的電鍍 48 第3章 結果與討論 49 3.1 NO2-電化學之評估 49 3.1.1 循環伏安行為探討 49 3.1.2 偵測NO2-電位之選擇 51 3.2 NO2-於晶片系統的量測 52 3.2.1 氧電漿處理 53 3.2.2 NaOH處理 56 3.2.3 矽烷化處理 58 3.2.4 NO2-偵測極限之探討 61 3.3 NO3-的偵測 61 3.3.1 鎘粒子對NO3-的還原 61 3.3.2 鎘區域式毛細管電泳晶片之偵測NO 63 3.4 雙工作電極之晶片式偵測NO 65 3.4.1 金電極對NO3-反應 66 3.4.2 鎘電極之電鍍及與NO3-的反應關係 66 3.4.3 鎘電極於晶片系統之量測 69 3.5 樣本調配方式與注入時間電場對訊號之影響 70 3.5.1 樣本分子以二次水配置法 70 3.5.2 注入時間對訊號的影響 72 3.5.3 注入電場對訊號之影響 74 第4章 結論及未來展望 77 4.1 較佳化之管道處理方法 77 4.2 鎘電極整合之毛細管電泳晶片 78 4.2.1 鎘沉積於注入管道 78 4.2.2 鎘沉積於工作電極 79 4.3 未來方向 79 參考文獻 80 自述 83 表目錄 表1-2 比較不同方法對血漿中NO2-、NO3-的偵測 15 表3-1 不同濃度之NO2-樣本分子以二次水泡製所量測出之導電度 70 圖目錄 圖1-1 腦中風的種類。 3 圖1-2 缺血性中風的機制。 3 圖1-3 NOS催化L-Arginine產生NO的反應。 11 圖1-4 NO所造成之神經毒連鎖反應。 13 圖1-5 NO於培養基中之反應。 14 圖1-6 傳統電泳分離原理。 18 圖1-7 毛細管電泳基本裝置圖。 18 圖1-8 毛細管於不同pH值下之表面狀態。 21 圖1-9 Stern模型。 22 圖1-10 不同帶電性於毛細管電泳中之視遷移率(ma) 。 24 圖1-11 不同帶電性分子在毛細管電泳中的分離情形。 24 圖1-12 EOF與層流的差異。 25 圖1-13 樣本濃縮原理示意圖。 26 圖1-14 樣本濃縮示意圖。 26 圖1-15 Leyi Gao等學者利用之管修飾及電壓之配置原理來分離陰離子。 27 圖1-16 Griess reagent反應。 28 圖1-17 電化學氧化還原反應所造成電流值的改變。 29 圖1-18 研究架構圖。 31 圖2-1 微小電極之製作流程圖。 38 圖2-2 微小金屬偵測電極之配置圖。 38 圖2-3 十字微流管道之製作流程。 40 圖2-4 晶片對準之相對距離示意圖。 41 圖2-4 管道中電沉積白金於接地及參考電極 42 圖2-5 三極式電化學量測系統。 43 圖2-6 毛細管電泳電化學偵測系統架構圖。 44 圖2-7 晶片示意圖。 44 圖2-8 EOF量測系統。 45 圖2-9 PDMS經氧電漿處理後之表面改質情形。 46 圖3-1 以金工作電極，Ag/AgCl參考電極，白金絲為輔助電極，掃引速度為0.1 V/s，於10 mM MES，pH 6.0下，含(a) 5 mM；(b) 2 mM；(c) 1 mM；(d) 0.5 mM；(e) 0 mM NO2-之循環伏安圖。 49 圖3-2 以金為工作電極，10 mM MES, pH 6.0下，定電位於+0.75 V，依次加入10, 20, 50, 100, 200 mM之NO2-，所呈現之時間對電流圖譜。 50 圖3-3 以金為工作電極，定電位+0.75 V下，不同濃度的NO2-所對應出電流值變化的檢量線。 50 圖3-4 以金工作電極，參考電極、輔助電極皆為白金絲，掃引速度0.1 V/s，在10 mM MES，pH 6.0下，含(a) 10 mM；(b) 5 mM；(c) 0 mM NO2-之循環伏安圖。 51 圖3-5 於晶片系統中，工作電極、輔助電極皆為蒸鍍之金，參考電極為電沉積之白金，掃引速度0.1 V/s，在10 mM MES，pH為6.0下，含(a) 10 mM；(b) 0 mM NO2-下之循環伏安圖。 52 圖3-6 下層玻璃晶片與上層，因未經任何處理的PDMS結合管道之故，可能造成的不均勻流速剖面圖。 53 圖3-7 (a)剛以氧電漿處理，與 (b)同一天內經過多次電泳實驗後之EOF。 54 圖3-8 以氧電漿處理之毛細管電泳圖譜。(a)為1 mM，(b)為0.1 mM NaNO2。 55 圖3-9 (a)以氧電漿處理後之EOF；(b)氧電漿處理後靜置17天後之EOF。 56 圖3-10 (a)為打氧電漿處理後第17天之EOF；(b)為(a)情況以0.2 M NaOH處理一小時後之EOF。 57 圖3-11 以0.2 M NaOH處理之毛細管電泳圖譜。樣本為10 mM NaNO2。 57 圖3-12 未經處理之PDMS晶片以0.2 M NaOH處理1 hr後之EOF結果。 58 圖3-13 矽烷化修飾過程。 59 圖3-14 矽烷化處理之EOF圖譜。 60 圖3-15 矽烷化處理之毛細管電泳圖譜。樣本各為(a)0.5 (b) 1 (c)5 (d)10 mM NaNO2 。60 圖3-16 由圖3-15所對應出之濃度對電流響應圖譜。 60 圖3-17 毛細管電泳以矽烷化修飾之偵測極限。樣本為0.1 μM NaNO2。 61 圖3-18 活化鎘粒子對NO3-還原時間之影響。 62 圖3-19 活化鎘粒子對NO3-的還原率。在glycine-NaOH buffer, pH 9.6(a)下，含(b) 10 mM NO3-；(c) 10 mM NO2-；(d) 10 mM NO3-經活化鎘粒子還原後之CV圖，掃引速度為0.1 V/s。 63 圖3-20 鎘區域式之毛細管電泳晶片示意圖。 63 圖3-21 鎘區域式之CEEC晶片偵測不同濃度NO3-結果。樣本(a) 5與(b)1 μM 之NO3-。 64 圖3-22 鎘沉積於注入管道中之毛細管電泳晶片用於偵測老鼠血漿樣本。 65 圖3-23 以雙工作電極同步偵測NO3-、NO2-之晶片示意圖。 65 圖3-24 以金工作電極，參考電極輔助電極皆為白金絲，在10 mM MES, pH 6.0下，含 (a)10 mM，(b) 5 mM，(c) 0 mM NO3-之循環伏安圖。 66 圖3-25 以金工作電極，參考電極Ag/AgCl，輔助電極白金絲，在CH3COONa/ CH3COOH，pH 4.5緩衝液中，含(a) 0.1 M；(b) 0 M CdSO4．8/3H2O之循環伏安圖，掃引速度為0.1 V/s。 67 圖3-26 以電沉積之鎘工作電極，滴加入不同濃度之NaNO3溶液，其時間對電流變化之圖譜。 68 圖3-27 以圖3-26所對照出NaNO3濃度對電流改變之圖譜。 68 圖3-29 搭配鎘電極之CEEC晶片對(a)100 mM與(b)10 mM NaNO3之電泳圖譜。 69 圖3-30 搭配鎘電極之CEEC晶片時不同濃度NaNO3對電流變化響應圖譜。 69 圖3-31 樣本分子以二次水泡製之電泳圖譜。(a)為20 μM , (b)為10 μM NaNO2。 71 圖3-32 在相同注入樣本時間，隨著時間、清潔次數、電泳次數，對樣本之推送可能造成影響之示意圖。 72 圖3-33 定電位+0.75 V，穩定20 sec後，以電場100 V/cm，進行注入100 sec，以電場80 V/cm進行分離之10 μM NaNO2電泳圖譜。 73 圖3-34 定電位+0.75 V，穩定20 sec後，以電場100 V/cm，進行注入150 sec，以電場80 V/cm進行分離之10 μM NaNO2電泳圖譜。 74 圖3-35 毛細管電泳於注入過程中之注入電壓之設定。 75 圖3-36 定電位+0.75 V，穩定20 sec後，以電場100 V/cm，進行注入200 sec，接以電場80 V/cm進行分離之10 μM NaNO2電泳圖譜。 75 圖3-37 定電位+0.75 V，穩定20 sec後，以電場600 V/cm，進行注入40 sec，接以電場80 V/cm進行分離之10 μM NaNO2電泳圖譜。 76

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    下載圖示 校內：2008-08-09公開
    校外：2009-08-09公開
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