簡易檢索 / 詳目顯示

回結果列表
研究生： 王翔鵬
Wang, Xiang-Pong
論文名稱： 含鄰位胺基酸綠色螢光蛋白發光團:合成、性質及應用
o-Aminoacid Analogues of Green Fluorescent Protein Chromophore : Synthesis, Properties and Applications
指導教授： 宋光生
Sung, Kuang-Sen
學位類別： 碩士
Master
系所名稱： 理學院 - 化學系
Department of Chemistry
論文出版年： 2019
畢業學年度： 107
語文別： 中文
論文頁數： 78
中文關鍵詞： 綠色螢光蛋白 、配位基 、雙螢光現象
外文關鍵詞： green fluorescent protein, ligand, dual fluorescence
相關次數： 點閱：130  下載：0 
分享至:
查詢本校圖書館目錄 查詢臺灣博碩士論文知識加值系統 勘誤回報

    • 近年來由於螢光技術的普及，加上使用時的簡單方便以及訊號的立即回饋性，分子型感測器已成為當今熱門的研究題材。而在生化領域中，綠色螢光蛋白由於能在生物體中透過分子間氫鍵而產生剛性結構，以至於在該環境下的螢光量子產率可高達0.8，並且在過去二十年來被許多研究人員廣泛地用作追蹤生體分子的螢光標籤。但是，若將其中的發光團(p-HBDI)單獨分離出來，其在激發態時會藉由環外雙鍵的扭轉而進行光異構化反應，導致在一般溶劑中螢光量子產率僅剩下10-3至10-4。本實驗將EDTA的性質結合至綠色螢光蛋白，合成出兩種皆對銅離子具有選擇性的多牙配位基，o-DOIMAA與o-DOIMDAA。然而，兩化合物與銅離子生成的錯合物彼此之間卻有著截然不同的螢光量子產率，因此我們藉由NMR來觀測銅離子對兩化合物滴定所造成的訊號的位移與強度的變化，並以此判斷兩錯合物結構上的差異。在後續的光譜分析中，我們發現兩化合物皆具有雙螢光現象，尤其o-DOIMAA在非質子溶劑具有雙螢光現象，但在質子溶劑中卻只能看到單一的螢光峰，所以我們也進一步地對化合物進行酸鹼滴定，並且同樣藉由酸化或中和特定部位所造成的UV和螢光圖譜上的訊號波長以及強度的改變來證實當中的光物理機構。並在最後結合前述的實驗結果對兩化合物在常溫下的熱異構化速率進行探討。

    In this experiment, the properties of EDTA were combined to green fluorescent protein, and two polydentate ligand, o-DOIMAA and o-DOIMDAA, which are very selective for copper ions, were synthesized. However, the complexes formed by the two compounds with the copper ions have completely different fluorescence quantum yields. Therefore, we monitored the titration of the two compounds by copper ions with NMR, according to the change of the chemical shift and intensity of the signal to assume the difference of structural between the two complexes. In the subsequent spectral analysis, we found that the two compounds have dual fluorescence, especially o-DOIMAA has dual fluorescence in the aprotic solvent, but only one fluorescent peak in the protic solvent. So we also used acid-base titration to test that two compounds and monitor them with UV and fluorescent spectra, observing the change of absorbance and fluorescence by intensity and wavelength to confirm the truth of photophysical mechanism behind that phenomenon.

    中文摘要 i 誌謝 ii 目錄 viii 表目錄 ix 圖目錄 x I 緒論 1 I-1 綠色螢光蛋白螢光傳感器發展與應用 1 I-2 綠色螢光蛋白發光團結構與生物合成機制 2 I-3 水母之綠色螢光蛋白發光機制 3 I-4水母綠色螢光蛋白之光譜性質 4 I-5 綠色螢光蛋白發光基團有機合成機構 6 I-6 激發態分子內電子轉移 7 I-6-1 光引發電子轉移(Photo-induced Electron Transfer, PET) 7 I-6-2激發態扭轉電荷轉移（Twisted Intramolecular Charge-Transfer, TICT） 8 I-6-3 激發態分子內氫轉移(Excited-state Intramolecular Proton Transfer, ESIPT) 10 I-6-4 以第一原理修正光引發電子轉移(PET)機制 12 I-7 綠色螢光蛋白光物理機制以及amino conjugation effect 15 II 結果與討論 18 II-1綠色螢光蛋白鄰位胺基酸衍伸物之合成 18 II-2 綠色螢光蛋白陽離子感測器 21 II-2-1陽離子檢測 23 II-2-2 計量化學(stoichiometry) 26 II-2-3結合常數(binding constant) 28 II-2-4 錯合物結構探討 30 II-2-5 o-DOIMAA螢光檢量線 36 II-3 綠色螢光蛋白鄰位胺基酸衍伸物之光物理性質研究 37 II-3-1 o-DOIMAA與o-DOIMDAA光物理物數據 37 II-3-2 化合物光譜分析 38 II-3-3 分子內電荷轉移機制探討 45 II-4綠色螢光蛋白鄰位胺基酸衍伸物之光熱異構化反應 56 II-5 ZnBr2水解產物探討 61 II-6 結論 63 III 儀器的使用與合成步驟 64 III-1實驗儀器的使用方法 64 III-2 化合物合成 65 III-2-1 2-methyl-4-(2-nitrobenzylidene)oxazol-5(4H)-one合成步驟 65 III-2-2 1,2-dimethyl-4-(2-nitrobenzylidene)-1H-imidazol-5(4H)-one合成步驟 65 III-2-3 4-(2-aminobenzylidene)-1,2-dimethyl-1H-imidazol-5(4H)-one,o-ABDI合成步驟 66 III-2-4 (Z)-tert-butyl 2-((2-((1,2-dimethyl-5-oxo-1H-imidazol-4(5H)-ylidene)methyl)phenyl)amino)acetate P5 合成步驟 67 III-2-5 (Z)-2-((2-((1,2-dimethyl-5-oxo-1H-imidazol-4(5H)-ylidene)methyl)phenyl)amino)acetic acid o-DOIMAA合成步驟 67 III-2-6 (Z)-di-tert-butyl 2,2'-((2-((1,2-dimethyl-5-oxo-1H-imidazol-4(5H)ylidene)methyl)phenyl)azanediyl)diacetate P5* 合成步驟 68 III-2-7 (Z)-2,2'-((2-((1,2-dimethyl-5-oxo-1H-imidazol-4(5H)-ylidene)methyl)phenyl)azanediyl)diacetic acid o-DOIMDAA合成步驟 69 IV引用文獻 70 附錄 73 表目錄 表 1，o-DOIMAA與o-DOIMDAA在各溶劑下的光物理數據 37 表 2，光熱異構化數據 59 圖目錄 圖 1，維多利亞多管發光水母 1 圖 2，artin Chalfie 團隊所測得的GFP激發波長與放射波長。右邊表示E.coli-generated GFP;左邊為表示從天然水母中純化得到的GFP 2 圖 3，綠色螢光蛋白生物合成機制[4] 3 圖 4，Fluorescence resonance energy transfer(FRET) 4 圖 5，受光激發氫轉移簡圖[6] 5 圖 6，綠色螢光蛋白在水蛋白質機團內示意圖 [2] 5 圖 7，綠色螢光蛋白發光結構合成機構[4] 6 圖 8，PET前沿軌域能階機構示意圖[12]。 8 圖 9，DMABN在不同溶劑下的螢光圖譜。(1) n-hexane (2) dibutyl ether (3) diethyl ether (4) buthyl chloride (5) acetonitrile 9 圖 10，DMBAN之TICT能階模型 10 圖 11，HBT之ESIPT範例[14] 11 圖 12，o-HBDI之ESIPT路徑圖[14] 12 圖 13，螢光質子感測器1，酸化前後機構與位能曲線示意圖 13 圖 14，陽離子感測器3，鍵結前後其機構與位能曲線示意圖 14 圖 15，stilbene光物理機制簡圖，1t*為激發態平面結構;1p*為激發態扭曲結構[16] 15 圖 16，下半部中，左側為最佳化結構；中間HOMO；右側為LUMO[16] 17 圖 17，o-ABDI合成機構 19 圖 18，o-ABDI衍伸物，合成機制 20 圖 19，o-DOIMAA在CH3CN+H2O(1:1)中的UV吸收 21 圖 20，o-DOIMAA在CH3CN+H2O(1:1)中，分別以次大吸收波長340nm以及最大吸收波長450nm所激發出的螢光波長 22 圖 21，o-DOIMDAA在CH3CN+H2O(1:1)中的UV吸收 23 圖 22，o-DOIMDAA在CH3CN+H2O(1:1)中，分別以次大吸收波長345nm以及最大吸收波長420nm所激發出的螢光波長 23 圖 23，o-DOIMAA陽離子測試UV光譜 24 圖 24，o-DOIMAA陽離子測試螢光光譜 24 圖 25，o-DOIMDAA陽離子測試UV光譜，上半部為沒有造成吸收改變的陽離子；下半部為造成吸收改變的陽離子。 25 圖 26，o-DOIMDAA陽離子測試螢光光譜 26 圖 27，o-DOIMAA對Cu2+的jobs plot 27 圖 28，o-DOIMDAA對Cu2+的jobs plot 28 圖 29，。計算o-DOIMAA與銅離子錯化物的結合常數的圖形。 29 圖 30，計算o-DOIMDAA與銅離子錯化物的結合常數的圖形。 30 圖 31，在MeOD中以銅離子滴定o-DOIMAA前後，NMR圖譜訊號變化 31 圖 32，(a)為加入銅離子靜置一段時間後2.4ppm甲基訊號的變化；(b)為推測單一o-DOIMAA對銅離子的鍵結方式 32 圖 33，銅離子滴定o-DOIMAA的UV圖譜，(a)部分右側為加入銅離子前；左側為加入銅離子後，(b)部分為其對銅離子的錯合物在UV燈下的螢光 33 圖 34，在MeOD中以銅離子滴定o-DOIMDAA前後，NMR圖譜訊號變化 34 圖 35，銅離子滴定o-DOIMDAA的UV圖譜，(a)部分右側為加入銅離子前；左側為加入銅離子後，(b)部分為其對銅離子的錯合物在UV燈下的螢光 35 圖 36，(a)為o-DOIMAA對銅離子的螢光檢量線；(b)為添加過量銅離子導致的螢光淬滅 36 圖 37，o-DOIMAA(salt)在各溶劑下的正規化吸收光譜。 38 圖 38，o-DOIMAA(salt)在各溶劑下以340nm為基準的吸收波長所激發的正規化螢光圖譜 39 圖 39，o-DOIMAA(salt)在各溶劑下以450nm為基準的吸收波長所激發的正規化螢光圖譜 40 圖 40，o-DOIMAA(salt)自吸收效應 41 圖 41，o-DOIMDAA(salt)在各溶劑下的正規化吸收光譜 42 圖 42，o-DOIMDAA(salt)在各溶劑下以340nm為基準的吸收波長所激發的正規化螢光圖譜 43 圖 43，o-DOIMDAA(salt)在各溶劑下以420nm為基準的吸收波長所激發的正規化螢光圖譜 43 圖 44 ，o-DOIMDAA(salt)自吸收效應 44 圖 45，o-DOIMAA(salt)再CH3CN溶劑中的ESIPT現象預測 45 圖 46，o-ABD在CH3CN溶劑中的酸鹼滴定之UV及螢光光譜變化 46 圖 47，o-DOIMAA鹼滴定之以340nm吸收波長激發的螢光圖譜變化 47 圖 48，o-DOIMAA鹼滴定之以450nm吸收波長激發的螢光圖譜變化 48 圖 49，o-DOIMAA鹼滴定之UV圖譜變化 48 圖 50 o-DOIMAA酸滴定之以340nm吸收波長激發的螢光圖譜變化 49 圖 51 o-DOIMAA酸滴定之以450nm吸收波長激發的螢光圖譜變化 50 圖 52，o-DOIMAA酸滴定之UV圖譜變化 50 圖 53，預測各種螢光背後結構的示意圖 52 圖 54，o-DOIMDAA鹼滴定之以340nm吸收波長激發的螢光圖譜變化 52 圖 55，o-DOIMDAA鹼滴定之以420nm吸收波長激發的螢光圖譜變化 53 圖 56 o-DOIMDAA鹼滴定之UV圖譜變化 53 圖 57，o-DOIMDAA酸滴定之以340nm吸收波長激發的螢光圖譜變化 54 圖 58，o-DOIMDAA鹼滴定之以420nm吸收波長激發的螢光圖譜變化 55 圖 59 -DOIMDAA酸滴定之UV圖譜變化 55 圖 60，o-DOIMAA與o-DOIMAA(salt)的照光前後NMR圖譜，(a)為照光前(b)為照光後 57 圖 61，o-DOIMDAA與o-DOIMDAA(salt)的照光前後NMR圖譜，(a)為照光前(b)為照光後 58 圖 62，一級速率式做圖 59 圖 63，溴化鋅羧酸水解法[30] 61 圖 64，左半部為該水解產物在MeOD中NMR的訊號變化；右半部為該水解產物MS訊號 61 圖 65，該水解產物在各溶劑中的UV螢光圖譜 62

    1. Shimomura, O.; Johnson, F. H.; Saiga, Y.J. Cell. Comp. Phsysiol. 1963, 59,223-29
    2. Tsien, R. Y. The Green Fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 509-544
    3. Chalfie, M.; Tu, Y.; Euskirchen, G.; Ward, W. W.; Prasher, D. C. Science. 1994. 263,802-805
    4. Heim, R.; Prasher,D. C.; Tsein, R. Y. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994, 91, 12501-12504
    5. Moberg, A. The Nobel Prize in Chemistry 2008 https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2008/advanced-information/
    6. The Chromophore of GFP：http://www.cryst.bbk.ac.uk/PPS2/projects/jonda/chromoph.htm
    7. Marder, S. R.; Marder, J. W. Perry. Science 1994, 263, 1706-1707.
    8. Yang, J. S.; Lin, Y. D.; Lin, Y. H.; Liao, F. L. J. Org. Chem. 2004, 69, 3517-3525.
    9. La Clair, J. J. Angew. Chem. Int. Ed. 1999, 38, 3045-3047.
    10. Jie, G.; Peng, Z.; Tai-bao, W.; Qi, L.; Hong, Y.; You-ming, Zhang. RSC. Adv. 2014, 4, 35797–35802
    11. Kowalczyk, T.; Ziliang, L.; Troy Van, V. J. Phys. Chem. A. 2010, 114, 38, 10427-10434
    12. Daniel, E. Acc. Chem. Res. 2016, 49, 1816−1824
    13. Zbigniew, R.; Grabowski, R.; Krystyna.; Wolfgang, R. Chem. Rev. 2003, 103, 3899-4031
    14. Jianzhang, Z.; Shaomin, J.; Yinghui C.; Huimin, G.; Pei, Y. Phys. Chem. Chem. Phys. 2012, 14, 8803–8817
    15. Kew-Yu, C.; Yi-Ming, C.; Cheng-Hsuan, L.; Cheng-Chih, H.; Mei-Lin, H.; Gene-Hsiang, L.; Pi-Tai, C. J. AM. Chem. Soc. 2007, 129, 4534-4535
    16. Jye-Shane, Y.; Shih-Yi, C.; Kang-Ling, L. J. AM. Chem. Soc VOL. 2002, 124, 11, 9, 2518-2527
    17. Yi-Hui, C.; b Robert, S. Kuangsen, S. Chem. Commun. 2019, 55, 8991-8994
    18. Yi-Hui, C.; Wei-Jen, L.; Kuangsen, S. J. Org. Chem. 2013, 78, 301−310
    19. Olivier, R.; Cécile. C.; Yannick, E.; Claude, D.; Sophie, F.; Claude, T. Org. Lett. 2013, 159, 2246-2249
    20. Volker, H.; Brigitte, D.; Vasilica, N.; Reinhard, S.; Daniel, G.; Dorothea, L.; Jenny, E.; Sandro, K.; Hiroshi, K.; Klaus, B.; Burkhard, W.; Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 7887 –7891
    21. O. Roy.; Cécile, C.; Yannick, E.; Claude, D.; Sophie, F.;†C. Claude, T. Org. Lett, 2013, 159, 2246-2249
    22. Yannis L. L. J. Phys. Chem. B. 1997, 101, 4863-4866
    23. Ongsheng, M.; Zhong, C.; Yating ,C.; Shu, L.; Qiufen, X.; Dongming, L.; Zhu, W.; Jiannan, X. Sensors. Actuators B. 2014, 192, 164– 172
    24. Nair, N.G; Smith, M.A; Reddy, V.P J. Alzheimers. Dis. 2010, 20(1), 57-66
    25. Syed Arshad, H. General Physics. 2009
    26. Yuning, H.; a Jacky, W. Y.; Lama.; Ben-Zhong, T. ab Chem. Commun. 2009, 4332–4353
    27. Dokic’, J.; Gothe, M.; Wirth, J. Peters, M. V.; Schwarz, j.; Hecht, S.; Saalfrank, P. J. Phys. Chem. A. 2009, 113, 6763–6773.
    28. Xiao-Mei, L.; Xing-Yi, J.; Zhi-Xiang, Z.; Jian, W.; Fu-Quan, B. RSC. Adv. 2018, 8, 11580–11588
    29. Ting-Ting, Y.; Zeng-Xia, Z.; Hong-Xing, Z. New J. Chem. 2017, 41, 1659--1669 | 1659
    30. Yong-qian, W.; David, C.; Limburg, D. E.; Wilkinson, Mark J. V.; Gregory S. H. Tetrahedron Letters. 2000, 41 2847–2849
    31. Ramesh, K.; Yann, B.; Zohreh, S.; Karl, A. H.; William, D. L. J. Org. Chem. 2004, 69, 6131-6133
    32. Henry, L.; Lauri, P. J. Am. Chem. Soc.1960, 82, 10, 2411-2416
    33. Nachippan, R.; Meenakshisundaram, S. J. Indian, Chem. 2018, 57A, 915-919
    34. Xiaoman, B.; Yi, P. Phys Chem B. 2016, 120(13), 3311–3317
    35. Pedro, L. M.; Patrik, R. C. J. Phys. Chem. B. 2009, 113, 2572–2577

    無法下載圖示 校內：2024-08-01公開
    校外：不公開
    電子論文尚未授權公開，紙本請查館藏目錄
    QR CODE