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研究生：	梁鏡麟 Liang, Jin-Ling
論文名稱：	以中孔徑分子篩固定酵素進行外消旋Naproxen三氟乙酯之水解分割 By employing mesoporous molecular sieve immobilized enzyme as the biocatalyst in the kinetic resolution of racemic Naproxen trifluoroethyl ester via hydrolysis
指導教授：	蔡少偉 Tsai, Shau-Wei
學位類別：	碩士 Master
系所名稱：	工學院 - 化學工程學系 Department of Chemical Engineering
論文出版年：	2004
畢業學年度：	92
語文別：	中文
論文頁數：	75
中文關鍵詞：	水解、Naproxen三氟乙酯、中孔徑分子篩
外文關鍵詞：	mesoporous molecular sieve, Naproxen trifluoroethyl ester, hydrolysis
相關次數：	點閱：76 下載：5
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　　本研究以表面經過不同矽烷類修飾之中孔徑分子篩為擔體，利用物理吸附或化學鍵結方法製備固定化Lipase MY。其次藉由測試固定化酵素之比反應性、鏡像選擇性、最佳反應溫度、長時間下的穩定性及耐溶劑性篩選最佳固定化方法。結果發現以環氧修飾的中孔徑分子篩得到之固定化酵素具有高鏡像選擇性、最佳反應溫度可提高10 ℃以及長時間處於60 ℃下穩定性仍表現不錯等優點。
　　以固定化酵素進行外消旋Naproxen三氟乙酯之水解動力分割時，利用Michaelis-Menten反應機構、產物抑制作用及酵素失活之動力模式，可以成功獲得與實驗值相當一致的結果。此外，並發現添加三辛基胺可有效減少酸抑制作用以及達到增加酵素反應性之效果。

　　Lipase MY have been immobilized on the surface of mesoporous molecular sieve that was functionalized with different organalkoxysilanes by using physical adsorption or chemical binding method. Then, the best immobilization method was selected by comparing the specific activity, enantioselectivity, the optimal reaction temperature, stability with time and solvent for various immobilized enzyme. Lipase MY immobilized onto the mesoporous molecular sieve modified with epoxide was found to possess high enantioselectivity, the optimal reaction temperature was enhanced 10 ℃, stability with time.
　　By employing immobilized enzyme as the biocatalyst in the kinetic resolution of racemic Naproxen trifluoroethyl ester via hydrolysis, agreements between the experimential data and best-fit results were found in which the Michaelis-Menten kinetic mechanism, coupled with effects product and enzyme deactivation were considered in the theoretical modeling. Moreover, the acid inhibition and the enhanced lipase activity were obtained when adding trioctylamine in the reaction medium.

總目錄

中文摘要	I
英文摘要	II
誌謝	III
總目錄	IV
內文目錄	V
表目錄	VIII
圖目錄	IX
符號說明	XIII















內文目錄

第一章　緒論
1-1　對掌性藥物	1
1-2　非類固醇消炎藥	4
1-3　酵素	5
1-4　脂肪分解酵素	6
1-5　有機溶劑中之酵素反應	9
1-6　中孔徑分子篩	11
1-7　酵素固定化	14
1-8  鹼的固定化	16
1-9　研究動機	16

第二章　原理
2-1　酵素之動力分割模式	18
   2-1-1  酵素催化水解	18
   2-1-2  酵素失活	20
   2-1-3  固定化酵素吸附模式	21
2-2　酵素之熱力學分析	21
2-3　鹼觸媒的消旋反應模式	23
   2-3-1  鹼消旋模式	23
   2-3-2  鹼催化無選擇性水解	25
2-4  酵素之動態動力分割	26


第三章　實驗方法
3-1　藥品與材料	27
3-2　實驗儀器設備	28
3-3　分析方法	29
3-4　實驗步驟	32
3-4-1　合成(S)或(R,S)-Naproxen三氟乙酯	32
3-4-2　中孔徑分子篩之表面修飾	32
3-4-3　熱重分析測量	33
3-4-4　酵素固定化	33
3-4-5　蛋白質吸附量分析	34
  3-4-6  酵素活性分析	34
3-4-7  氮氣等溫吸附 / 脫附測量	35
3-4-8  不同溫度及溶劑下對酵素水解反應的影響	35
3-4-9  不同基質濃度之酵素水解初速率	35
3-4-10 產物的抑制作用	36
3-4-11 三辛基胺的影響	36
3-4-12 鹼觸媒消旋反應	36
3-4-13 鹼觸媒對動態動力分割外消旋Naproxen三氟乙酯之影響	37

第四章  結果與討論
4-1　中孔徑分子篩的表面修飾探討	38
   4-1-1  前言	38
   4-1-2  修飾方法對擔體的影響	38
   4-1-3  吸附實驗	41
4-2　酵素固定化	41
   4-2-1  修飾擔體的簡述	41
   4-2-2  固定化條件之決定	42
   4-2-3  固定化酵素的物理分析	43
4-3　固定化酵素催化水解動力分割比較	43
   4-3-1  酵素吸附量的估計	43
   4-3-2  水解動力分割比較	43
4-4　不同溫度及溶劑對固定化酵素的影響	47
   4-4-1  不同反應溫度的影響	47
   4-4-2  不同溶劑的影響	49
4-5　熱力學的探討	54
4-6　酵素催化水解動力分割之參數偶合	56
   4-6-1  動力學參數偶合	56
   4-6-2  產物抑制參數偶合	58
   4-6-3  理論值與實驗值偶合	58
4-7  三辛基胺的影響	60
4-8  固定化鹼催化消旋反應之參數偶合	63
4-9  動態動力分割	67

第五章  結論	69

參考文獻	71



表目錄

表1-1　鏡像異構物之製造途徑	3
表1-2  美國對掌異構物技術市場規模	3
表1-3  商業上可購得的脂肪分解酵素	7
表1-4  各式工業使用之酵素	8
表1-5  一般常用有機溶劑之log P值	10
表1-6  孔徑大小的分類	11
表4-1　矽烷類的結構式	38
表4-2　代名詞對照表	39
表4-3　不同修飾擔體與固定化酵素的BET及TGA之結果	41
表4-4　不同固定化酵素一覽表	45
表4-5	不同反應系統下的熱力學參數	54












圖目錄

圖1-1　2-丁醇之鏡像異構物	1
圖1-2　外消旋Naproxen結構式	4
圖1-3　非類固醇消炎藥之化學結構分類	4
圖1-4　MCM-41形成途徑	12
圖1-5  後修飾法的可能機制	13
圖1-6  鹼的固定化	16
圖1-7  論文架構圖示	17
圖2-1　脂肪分解酵素催化鏡像異構物之乒乓機構示意圖	18
圖2-2　外消旋Naproxen三氟乙酯之動力分割	19
圖2-3　外消旋異構物之酵素催化水解動力分割反應機構圖	19
圖2-4　自由能能階示意圖	22
圖2-5　Naproxen三氟乙酯之質子化與去質子化	23
圖2-6　酵素催化外消旋Naproxen三氟乙酯之動態動力分割	26
圖3-1　高效能液柱層析儀(HPLC)分析結果	30
圖3-2  含飽和水異辛烷中以1 mM二硝基甲苯為內標準物之(S)- Naproxen三氟乙酯和(S)-Naproxen檢量線	31
圖3-3  吸光值與酵素濃度之檢量線	34
圖4-1  表面修飾矽烷類之擔體示意圖	39
圖4-2  不同修飾擔體，其重量損失百分率隨溫度變化之關係圖	40
圖4-3　不同修飾擔體的脫附孔徑分佈比較圖	40
圖4-4	以不同修飾擔體於含45 ℃飽和水的異辛烷中進行2.5 mM外消旋Naproxen三氟乙酯吸附實驗，濃度隨時間變化之關係圖	42
圖4-5  不同修飾擔體與固定化酵素的BJH脫附孔徑分佈比較圖	44
圖4-6	不同固定化酵素於含45 ℃飽和水的異辛烷中進行2.5 mM外消旋Naproxen三氟乙酯之動力分割，(S)型氧酯轉化率(XS)隨時間變化之關係圖	45
圖4-7	以粗酵素為觸媒於含飽和水異辛烷中進行2.5 mM外消旋Naproxen三氟乙酯之動力分割時，(S)型氧酯轉化率(XS)隨時間變化之關係圖	48
圖4-8	異辛烷中粗酵素之鏡像選擇性與比反應性隨溫度變化之關係圖	48
圖4-9	以L-M-擔體為觸媒於含飽和水異辛烷中進行2.5 mM外消旋Naproxen三氟乙酯之動力分割時，(S)型氧酯轉化率(XS)隨時間變化之關係圖	50
圖4-10	異辛烷中L-M-擔體之鏡像選擇性與比反應性隨溫度變化之關係圖	50
圖4-11	以L-E-C4-擔體為觸媒於含飽和水異辛烷中進行2.5 mM外消旋Naproxen三氟乙酯之動力分割時，(S)型氧酯轉化率(XS)隨時間變化之關係圖	51
圖4-12	異辛烷中L-E-C4-擔體之鏡像選擇性與比反應性隨溫度變化之關係圖	51
圖4-13	以粗酵素為觸媒於含飽和水環己烷中進行2.5 mM外消旋Naproxen三氟乙酯之動力分割時，(S)型氧酯轉化率(XS)隨時間變化之關係圖	52
圖4-14	以L-M-擔體為觸媒於含飽和水環己烷中進行2.5 mM外消旋Naproxen三氟乙酯之動力分割時，(S)型氧酯轉化率(XS)隨時間變化之關係圖	52
圖4-15	以L-E-C4-擔體為觸媒於含飽和水環己烷中進行2.5 mM外消旋Naproxen三氟乙酯之動力分割時，(S)型氧酯轉化率(XS)隨時間變化之關係圖	53
圖4-16	環己烷中L-E-C4-擔體之鏡像選擇性與比反應性隨溫度變化之關係圖	53
圖4-17	不同溫度下ln E與絕對溫度倒數之關係圖	55
圖4-18	不同反應系統下的-△S-R△H及-△S-R△S之關係圖	55
圖4-19	(R)-Naproxen三氟乙酯在L-E-C4-擔體與異辛烷間之分配係數關係圖	57
圖4-20	(S)-Naproxen三氟乙酯初始反應速率及其初始濃度之關係圖	57
圖4-21	(S)-Naproxen三氟乙酯初始反應速率倒數與(S)-Naproxen濃度之關係圖	59
圖4-22	(S)-Naproxen三氟乙酯初始反應速率倒數與三氟乙醇濃度之關係圖	59
圖4-23	不同外消旋Naproxen三氟乙酯初始濃度，(S)型氧酯轉化率(XS)隨時間變化之關係圖	61
圖4-24	添加不同三辛基胺濃度對(S)型氧酯轉化率(XS)的影響	62
圖4-25	(S)型氧酯比反應初速率與三辛基胺濃度(B)之關係圖	62
圖4-26	1 mM (S)-Naproxen三氟乙酯在10 mM P-TBD下，ln(eeS/eeS0)隨時間變化之關係圖	64
圖4-27	1 mM (S)-Naproxen三氟乙酯在10 mM P-TBD下，ln[((SS) - (SR))/((SS0) - (SR0))]隨時間變化之關係圖	64
圖4-28	1 mM (S)-Naproxen三氟乙酯在不同MCM-TBD濃度下，ln(eeS/eeS0)隨時間變化之關係圖	65
圖4-29	MCM-TBD之消旋常數與MCM-TBD濃度(B)之關係圖	65
圖4-30	1 mM (S)-Naproxen三氟乙酯在不同MCM-TBD濃度下，ln[((SS) - (SR))/((SS0) - (SR0))]隨時間變化之關係圖	66
圖4-31	MCM-TBD之鹼催化水解常數與MCM-TBD濃度(B)之關係圖	66
圖4-32	45 ℃及60 ℃下，添加10 mM P-TBD與10 mg ml-1 L-E- C4-擔體於含飽和水異辛烷中進行1 mM外消旋Naproxen三氟乙酯之動態動力分割	68

















符號說明

AS，Ai，AQ 	分別為(S)型基質、內標準物及(S)型酸的積分面積
(B)	鹼觸媒濃度，(mM)
CS，Ci，CQ	分別為(S)型基質、內標準物及(S)型酸的濃度，(mM)
E	鏡像選擇比值
(E)t	酵素濃度，(mg ml-1)
ees，eep	基質及產物鏡像過剩比值
eeS0	時間為零時之基質鏡像過剩比值
f 	比例常數
△GS，△GR	(S)、(R)型過渡狀態與基態自由能之差，(kJ mol-1)
△S-R△G	(S)型與(R)型過渡狀態自由能之差，(kJ mol-1)
△S-R△H	(S)型與(R)型過渡狀態焓之差，(J mol-1)
(I)	抑制物濃度，(mM)
K	分配係數，(mol mg-1 mM-1)
KI	抑制物動力參數，(mM)
KQ，KP	酸抑制參數、醇抑制參數，(mM)
k1，k3，k1’，k3’	(S)、(R)型基質之動力參數，參考圖2-3，(ml h-1 mg-1)
k-1，k-3，k2，k4	(S)型基質之動力參數，參考圖2-3，(mM ml h-1 mg-1)
k-1’，k-3’，k2’，k4’	(R)型基質之動力參數，參考圖2-3，(mM ml h-1 mg-1)
k5	抑制物之動力參數，參考圖2-3，(ml h-1 mg-1)
k-5	抑制物之動力參數，參考圖2-3 ，(mM ml h-1 mg-1)
kd	酵素失活常數，(h-1)
Km，Km’	(S)型及(R)型之酵素動力常數，(mM)
kint	消旋速率常數，(h-1)
khyd	自發性水解速率常數，(h-1) 
log P	有機溶劑於正辛醇與水兩相間之分配係數的對數值
(P)	三氟乙醇濃度，(mM)
(QS)，(QR)	(S)型及(R)型Naproxen濃度，(mM)
△S-R△S 	(S)與(R)型過渡狀態熵之差，(J mol-1 K-1)
(S)，(SS)，(SR)	分別為外消旋、(S)型及(R)型基質濃度，(mM)
(S0)，(SS0)，(SR0)	分別為外消旋、(S)型及(R)型基質之初始濃度，(mM)
(S)S	基質達吸附平衡後在固定化酵素上之濃度，(mol mg-1)
(S)l	基質達吸附平衡後在溶液中之濃度，(mM)
t	時間，(h)
VS，VR	          分別為(S)型及(R)型基質之初始速率，(mM h-1)
W	水
Xt，XS，XR	分別為總轉化率、(S)型及(R)型基質轉化率


                                    

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校內：2005-07-20公開
校外：2005-07-20公開

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